生物安全柜、台式离心机、旋涡震荡器、拭子、采样管、无菌病毒采样液、1.5 ml无核酸酶的离心管、全自动荧光PCR检测仪专用PCR扩增管和核酸分离试剂盒(硅胶膜吸附法，北京金豪制药股份有限公司，Cat：BJH101)。
　　　　【储存条件及有效期】-20℃冷冻保存，有效期2个月，阳性对照反复冻融次数不得超过5次。
　　　　【适用仪器】RG3000、LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自动荧光PCR检测仪。
　　　　【样本要求】
　　　　1. 样本类型：咽拭子。推荐使用金豪公司生产的微生物采样及运送管（12人份/盒）。
　　　　2. 拭子、采样管和保存液：
　　　　2.1拭子选择：应使用头部为合成纤维（例如，聚酯纤维），杆部为铝或塑料的拭子。
　　　　2.2采样管：外螺旋口、耐-70℃冻存，可容纳3 ml病毒采样液。
　　　　2.3无菌病毒采样液：应含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生产的抗生素，缓冲液，经无菌处理。
　　　　3.样本采集、运输和保存：
　　　　由于H7N9亚型禽流感病毒为呼吸道传播病毒，有关生物安全应按照“《人间传染的病原微生物名录》”中高致病性禽流感病毒进行管理。
　　　　3.1采集：采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用微生物采样及运送管内的采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3ml保存液的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。4℃暂存并在48小时内送达实验室。
　　　　3.2保存和运输：新鲜采集样本应在4℃条件下48小时运送到检测实验室。保存样本可在-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。冷冻样本应在冷冻条件下送至实验室。运输时在包装箱内填充吸水材料，运输过程中保持标本采集管直立状态，不能倾斜。
　　　　样本送至实验室后，立即进行处理和分装，避免反复冻融。临床样本保存在4℃不能超过4天。
　　　　4.咽拭子标本的处理
　　　　咽拭子要在标本保存液中充分搅动（至少 40 下），以洗脱拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在4℃条件下，10000rpm离心20分钟，用上清接种细胞或直接提取RNA。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。
　　　　【检验方法】
　　　　1. 核酸提取：
　　　　取200μl咽拭子样本进行核酸提取。采用北京金豪制药股份有限公司的核酸分离试剂盒 (硅胶膜吸附法)，该试剂盒可用于对呼吸道悬浮液样本中的病毒RNA提取，并按试剂盒说明书要求操作。
　　　　本品的阳性对照和阴性对照均参与核酸提取。
　　　　1.1. 准备及注意事项：
　　　　1.1.1 分别在洗液A瓶和洗液B瓶中加入16ml和60ml无水乙醇，颠倒充分混匀，并在瓶身上加以标识。
　　　　1.1.2 吸取所需的洗脱液，加至一无核酸酶的eppendorf管中，于70℃预热。
　　　　1.1.3 冷冻样本应室温融化，轻微震荡混匀后使用。
　　　　1.1.4 区分操作中的离心设置（rpm和g），本产品操作过程均为室温离心。
　　　　1.1.5 助沉剂在低温保存时可能呈胶状，吹打混匀即可使用。
　　　　1.2. 样本裂解及核酸吸附
　　　　1.2.1 在1.5ml无核酸酶的离心管中加入10μl助沉剂和400μl裂解液，加入200μl待处理样本，剧烈震荡2分钟，室温静置10分钟。
　　　　注：如样本体积小于或大于200μl，需按比例改变助沉剂、裂解液以及无水乙醇体积。体积大于400μl样本应分多次进行处理。
　　　　1.2.2 加入480μl无水乙醇，颠倒混匀，吸取600μl裂解混合物转移到核酸吸附柱中。
　　　　注：如样本体积小于或大于200μl，需按比例改变乙醇用量。
　　　　1.2.3 3500g离心2分钟，取下套管，倒掉套管中的液体。将剩余裂解混合物转移至核酸吸附柱，重新离心一次，弃套管中的液体。
　　　　1.2.4 将核酸吸附柱重新装入套管，6000g离心1分钟，倒掉套管中的液体。
　　　　1.3. 核酸纯化
　　　　1.3.1 将核酸吸附柱重新装入套管，在核酸吸附柱中加入500μl洗液A，6000g离心1分钟，将核酸吸附柱装入一个干净套管中。
　　　　1.3.2 在核酸吸附柱中加入500μl洗液B，静置1分钟，6000g离心1分钟。
　　　　1.3.3 倒掉套管中的液体，将核酸吸附柱重新装入套管。
　　　　1.3.4 重复一次1.3.2步骤(本步骤不用静置1分钟)。
　　　　1.3.5 将核酸吸附柱换一新套管，13000rpm离心3分钟。

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