【主要组成成分】
组分名称 规格 数量
PCR检测试剂 AIV H7 PCR反应液A 816µl/管 1
AIV N9 PCR反应液A 816µl/管 1
AIV H7N9 PCR反应液B 288µl/管 1
AIV H7N9内标溶液 240µl/管 1
质控品 阴性质控品 200µl/管 1
AIV H7N9阳性质控品 200µl/管 1

　　　　【储存条件及有效期】保存于-20±5℃，反复冻融次数＜5次，有效期9个月。
　　　　【适用仪器】ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等荧光定量PCR仪。
　　　　【样本要求】
　　　　1 适用样本类型：呼吸道样本、血清、肺组织。
　　　　2 样品采集、保存与运送。
　　　　标本采集、保存、运送请遵循《人感染H7N9禽流感病毒标本采集及实验室检测策略》。
　　　　【检验方法】
　　　　1.核酸提取
　　　　建议取200µl液态样本进行核酸提取；组织样本可以研磨液进行提取操作。可采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取试剂盒，请按照试剂盒说明书进行操作；也可选择其他合适的商业化产品。本试剂盒中的内标溶液参与提取过程，若提取试剂盒中未说明内标的使用方法可在每200µl样本中加入4µl内标溶液后进行核酸提取。
　　　　本试剂盒中的阴性质控品参与提取，用于对环境进行监控；AIV H7N9阳性质控品不参与提取，用于PCR检测试剂的质控。
　　　　2.PCR扩增（ABI 7500仪器操作为例，ABI 7300、LC480等仪器参照此操作及仪器操作手册）
　　　　2.1分别配制AIV H7 RT-PCR反应体系和AIV N9 RT-PCR反应体系
　　　　2.1.1 AIV H7 RT-PCR反应体系配制
　　　　取适量PCR反应管（按AIV H7反应体系计算）；每管加入AIV H7 PCR反应液A 17µl、AIV H7N9 PCR反应液B 3µl（也可按照单个反应的用量，计算PCR反应液A、B各自所需总量，两者混匀后分装20µl于单个PCR反应管中）。
　　　　2.1.2 AIV N9 RT-PCR反应体系配制
　　　　取适量PCR反应管（按AIV N9反应体系计算）；每管加入AIV N9 PCR反应液A 17µl、AIV H7N9 PCR反应液B 3µl（也可按照单个反应的用量，计算PCR反应液A、B各自所需总量，两者混匀后分装20µl于单个PCR反应管中）。
　　　　2.2 于上述PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、AIV H7N9阳性质控品、待测标本核酸各5µl，8,000rpm离心数秒，放入PCR扩增仪。
　　　　2.3探针检测模式设置为：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye：NONE，Reporter Dye2：Vic，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference：NONE。反应条件设置为：50℃ 15min，1个循环；95℃ 15分钟，1个循环；94℃ 15秒→58℃ 45秒（收集荧光），45个循环。保存文件，运行。
　　　　3.结果分析
　　　　3.1 反应结束后保存检测数据文件。
　　　　3.2 分析条件设置：根据分析后图像调节Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果。
　　　　【质量控制】
　　　　阴性质控品：FAM检测通路扩增曲线无对数增长期，VIC检测通路扩增曲线为明显对数增长期；
　　　　阳性质控品：FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，且FAM检测通道扩增曲线 Ct值≤32；
　　　　以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
　　　　【结果判定】
　　　　1.如果检测样品的AIV H7及N9 RT-PCR反应体系FAM检测通道均无扩增曲线或Ct值＞40，且在VIC检测通道均有对数增长期，可判样品为H7N9禽流感病毒阴性；
　　　　2.如果检测样品的AIV H7及N9 RT-PCR反应体系扩增曲线在FAM,VIC检测通道均有对数增长期且FAM检测通道Ct值≤40；可判样品为H7N9禽流感病毒阳性；
　　　　3.如果检测样品的AIV H7或N9 RT-PCR反应体系仅其中之一的扩增曲线满足判为阳性的要求，则需重复检测；若重复检测结果为H7及N9均阳性，则判H7N9禽流感病毒阳性；若重复检测结果仍为H7（或N9）阳性，则只能判禽流感病毒H7（或N9）亚型阳性，并建议以其他方法做进一步确认。

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